HISTORIA

El Laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral

En la década de 1960 se formaron dos grupos de investigación en la Cátedra de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Médicas de Rosario, uno de ellos dedicado a investigaciones en Inmunología y a realizar los primeros intentos en Biología Molecular (análisis de ARN) dirigidas por Mauricio Londner y las dedicadas a la Biología Ósea, a mi cargo.

Pocos años mas tarde, cuando los grupos se habían definido y publicaban sus trabajos, resolvimos con Mauricio que sería adecuado tener algún “rótulo” que nos identificara, y así aparecieron en la Facultad el Instituto de Inmunología y el Laboratorio de Biología Ósea.

Por qué Biología Ósea? Entre 1961 y 1966 mis investigaciones intentaron explicar por qué la dehidroepiandrosterona, un esteroide producido por las glándulas adrenales circulaba en plasma como éster sulfúrico.  Como suele suceder frecuentemente cuando se trabaja casi en soledad, hacia 1966 decidí que avanzar en la fisiología de los esteroides iba a exigir un equipamiento que no tenía y que la competencia nacional, concentrada en el Instituto de Biología Experimental (fundado por el Dr. Bernardo Houssay) tenía varios investigadores en el tema y disponía de mayores recursos y experiencia.

Hacia 1967 me planteé cambiar el tema de investigación y analicé dos alternativas. Dedicarme a estudiar el tejido nervioso ó el tejido óseo, que parecían áreas “tranquilas” de investigación. Después de analizar las posibilidades de ambas áreas (literatura y modelos experimentales disponibles), quizá porque me pareció más sencillo, elegí el tejido óseo (aún hoy el tejido nervioso me sigue pareciendo extraordinariamente complejo). 

Buena parte de la decisión fue inducida fuertemente por una conversación con el Dr. Osvaldo Garrocq, a la sazón Director del Centro de Biología (actualmente Bioterio Central) de la Facultad.  El Dr. Garrocq me entusiasmó con la posibilidad de comenzar a experimentar con el cultivo in vitro de tejido óseo, en el que tenia experiencia.  Su ayuda fue clave por su entusiasmo y generosidad para proveer los recursos de los cuales era productor. El cultivo de hueso embrionario de ave requiere gallos, gallinas y sus huevos y material de vidrio estándar. De los gallos se obtiene plasma de composición estable, sin las grandes variaciones en las concentraciones de hormonas, que las gallinas exhiben durante la época de postura.

El Centro de Biología poseía todos los elementos necesarios: Garrocq llevaba adelante un programa de selección de gallinas y en consecuencia:
a) podíamos extraer sangre de los gallos por punción cardíaca. El plasma de ave es muy rico en fibrinógeno y cuando coagula tiene una consistencia firme (semejante a la de los medios de cultivo de bacterias, con agar) que permite soportar el crecimiento de los huesos colocados sobre él, para que se nutrieran por contacto. 
b) proveía huevos embrionados, los que después de incubados 12 días producían los embriones. De éstos, por disección en condiciones asépticas se obtenían los dos hemifrontales (razonablemente planos y delgados), objeto del cultivo. El resto de los embriones se homogeneizaba con volúmenes iguales de solución de Krebs. Después de centrifugar el homogeneizado se obtiene un fluido que contiene todos los factores de crecimiento y es rico en proteínas de carácter básico que por ello provocan el acomplejamiento de la heparina usada como anticoagulante y permiten la coagulación del plasma.

Una ventaja del tema, que aprecié rápidamente en aquel momento, fue la del reducido número de revistas a consultar: Clinical Orthopedics and Related Research (única revista con trabajos de cirugía, investigación clínica y biología básica del tejido), la recientemente aparecida Calcified Tissue Research,  el Journal of Clinical Investigation (para investigaciones clínicas) y algún artículo en Experientia, Science o Nature.

Comparado con los requerimientos actuales del cultivo de tejidos (complejos medios de cultivo y ambiente sofisticado de trabajo: campanas de flujo laminar, incubadoras con atmósfera gaseosa controlada, etc.), aquellos cultivos parecen elementales. Sin embargo nuestros experimentos tuvieron buena repercusión, fueron aceptados por la primera revista especializada  Calcified Tissue Research (después llamada Bone & Mineral) y fui miembro de su Comité Editorial entre 1984 y 1989.

Como relaté al principio, decidimos con Mauricio Londner que sería adecuado tener algún “rótulo” que nos identificara, y así aparecieron en la Facultad el Instituto de Inmunología y el Laboratorio de Biología Ósea. Este nombre, también tiene su pequeña historia.

Años atrás había trabajado en un laboratorio que tenía un cartel, pegado en la pared, que decía:

Laboratorio.
Por favor, las primeras cinco, no las últimas ocho.

Quizá marcado  por el lema o porque mi carácter es enteramente compatible con él, el nombre de Laboratorio me pareció mas adecuado. No requiere aprobaciones especiales ni es exigible su perduración en el tiempo: un laboratorio implica solamente que en él se trabaja en el tema del calificativo. Iniciamos el expediente correspondiente y el 24 de Septiembre de 1987 quedó constituido el Laboratorio de Biología Ósea, aprobado por Resolución Nº 556/87del Consejo Directivo de la Facultad de Ciencias Médicas, operando en instalaciones de la Cátedra de Química Biológica.

El Dr. Guillermo Celoria, experto patólogo fue, durante muchos años, nuestro asesor en la histología ósea, complemento de nuestros experimentos. El fue quien suministró la radiografía de un corte del extremo proximal de un fémur humano, que ilustra la belleza de la estructura espacial del hueso trabecular y lo elegí como logotipo del Laboratorio.

En 1975 comencé a tomar responsabilidades en la dirección de la Cátedra de Química Biológica, y fue natural ampliar el grupo de trabajo.  En ese momento nuestra capacidad operativa se limitaba a trabajar con no más de seis ratas por vuelta experimental. El grupo inicial estaba formado por Martha Locatto, José Luis Ferretti, María del Carmen Fernández, Marta Orsatti y José L. Valenti. Con el tiempo se sumaron otros investigadores como se describe mas abajo con motivo del Premio obtenido en 1995.  El trabajo de atención de los animales y los análisis químicos e histológicos se distribuían entre todos, con gran entusiasmo.

En la década de 1970, recibimos la intensa influencia del Dr. Sol Rabasa Director del Instituto de Fisiología. Nos invitó a que nos asociáramos a la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y presentáramos nuestros resultados en la Reunión Anual. Allí conocí al Dr. Carlos Mautalen, que había iniciado investigaciones en conejos para investigar la calcinosis del ganado, conocida como “Enteque Seco” y producida por la ingestión de hojas de una planta propia de zonas bajas e inundables llamada “duraznillo blanco”. El Dr. Mautalen había interesado a un químico de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA para que aislara e identificara el principio activo causante del enteque. El avance del trabajo requería la verificación de la actividad osteolítica, en un modelo experimental que a diferencia del conejo adulto, requiriera montos pequeños de las fracciones del extracto de las hojas del duraznillo blanco, cuya preparación era muy costosa y laboriosa.

Y por esta vía, el Enteque Seco llegó al Laboratorio, nos entusiasmamos con el tema, tanto como modelo experimental para el estudio de la calcinosis como por su probable importancia económica respecto de la producción animal. Comenzamos a explorar el cuadro utilizando como modelo experimentales, tanto el cultivo de hueso embrionario de pollo como alimentando ratas con una comida que contenía polvo de las hojas secas de duraznillo blanco.

Publicamos en 1991 una revisión del tema titulada Calcinosis del Ganado en la República Argentina y en 1995, en colaboración con el Dr. John Bingley la versión en inglés: Calcinosis of cattle in Argentina. Ambos títulos fueron publicados por la editorial UNR Editora. El Dr. Bingley, de origen australiano, formó parte del grupo de expertos contratados por el INTA en  la década de 1950 para el análisis de una serie de cuadros clínicos del ganado residente en la Depresión del Salado (Provincia de Bs. As.).

En 1995 con motivo de la celebración del 75º Aniversario de la creación de la Facultad de Ciencias Médicas presentamos una síntesis de nuestro trabajo, titulado “Investigaciones sobre la biología del tejido óseo y el metabolismo mineral y de factores que los afectan” al concurso organizado por la Fundación Facultad de Ciencias Médicas y obtuvimos el Primer Premio a la Investigación Científica.

Además de los nombrados el grupo se enriqueció con más colaboradores, todos miembros del grupo docente de la Cátedra de Química Biológica: Lucila Hinrichsen, Adriana Dusso, María C. Vidal, Digna A. Caferra, Juan C. Ballina, Ana Masoni, Alfredo Rigalli, Hilda Abranzon, Eriberto Roveri y Marta B. Orsatti de la Cátedra de Fisiología de nuestra Facultad y  el profesor de Fisiología de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Dr. Guillermo Juster.

Me incorporé como Investigador Principal al CONICET en 1980. Obtuve la colaboración de dos técnicos profesionales de esa institución: Nelly Pérez Jimeno desde 1983  hasta su retiro en 2000 e Hilda S. Moreno desde 1998 al presente. Y desde el principio de nuestra actividad hasta 2005 (cuando fue ascendido) disfrutamos de la invalorable ayuda (por eficiencia y espíritu de cuerpo) de Próspero Tumello. Presenté al CONICET a Alfredo Rigalli quien fue incorporado como investigador adjunto en 2001, y éste a su vez presentó a  Lucas Brun, que obtuvo la beca de iniciación en 2006.

La serie de facetas de la biología ósea analizadas en los últimos 40 años es larga. Hemos investigado el efecto de la inmovilización sobre el hueso, los efectos de una dieta enriquecida en galactosa, el efecto de los estrógenos, de la administración crónica de bicarbonato en la dieta, la diabetes experimental (por pancreatectomía o por administración de aloxano) sobre el tejido óseo y el metabolismo de fosfato y el efecto in vitro de la insulina sobre la bioquímica de las células óseas, el crecimiento de la masa ósea en dos líneas de ratas endocriadas. Las investigaciones sobre la calcinosis en la rata, además, nos condujeron a experimentar en la hemopoyesis y metabolismo del hierro, analizar la riqueza en actividad antirraquítica y la estructura química del glucósido contenido en las hojas del duraznillo blanco.  El análisis de los títulos de los trabajos publicados en nuestra página web ilustrará al lector sobre nuestro trabajo de investigación.

El trabajo con las ratas nos condujo a poner a punto una serie de técnicas de laboratorio. Y nos dimos cuenta que podíamos sumar la capacidad operativa del Laboratorio de Biología Ósea (nuestras habilidades y el conocimiento de la metodología de la investigación) ampliando nuestro trabajo e influencia al realizar trabajos de investigación clínica. En 1988 encontré ese contacto en la persona del profesor de Ginecología, el Dr. Roberto Tozzini quien nos presentó a su colaborador, el Dr. Roberto A Bocanera que estaba formando un grupo de investigaciones sobre el climaterio. La colaboración ha permanecido productiva hasta el presente.

El flúor es un reconocido agente anabólico con intensa actividad sobre las células óseas. Las investigaciones centradas en este elemento fueron inducidas por sus notorias ventajas: era empleado como agente terapéutico, barato (quizá su inconveniente principal), no se metabolizaba a otra especie y se podía medir con precisión aun en cantidades nanomolares. Los estudios con fluoruro de sodio fueron iniciados por Adriana Dusso, después de concluir con su tesis doctoral. Y cuando Adriana emigró a los Estados Unidos, Alfredo Rigalli tomó a su cargo el tema. Los estudios con fluoruro de sodio condujeron al análisis del metabolismo del monofluorfosfato de sodio. Conducido por Alfredo el campo de investigación: del flúor se amplió considerablemente, comenzando por la demostración de que su biodisponibilidad del monofluorfosfato era doble de la del fluoruro, el hallazgo de la interacción con las proteínas del suero, en particular la alfa-2-macroglobulina y C3, la identificación de varios compartimiento plasmáticos de flúor, el perfeccionamiento de la técnica de medición de flúor, la inhibición transitoria de la secreción de insulina, etc. Alfredo Rigalli atrajo a un número  importante de colaboradores y comenzó a formar su grupo de investigación. En el informe anual del Laboratorio de 2005 destacaba su trabajo en la conducción y producción del Laboratorio. La producción de Alfredo Rigalli puede evaluarse revisando esta página.                                      

En 1995 incorporamos a una antropóloga, la Dra. Silvia Cornero, que nos introdujo en la paleopatología ósea, aplicada al material obtenido en exhumaciones de un yacimiento de 1700 años antes del presente, según datación efectuada en el Laboratorio de Tritio y Radiocarbono (U. N. La Plata). El sitio aludido está cerca de la población de Alejandra en la Provincia de Santa Fe.

El Laboratorio favoreció la formación del ambiente de trabajo y estudio necesario para la realización de las siguientes Tesis de Doctorado:

    * 1971. Jorge A. Gregoret. Doctor en Odontología. Tesis: Características del colágeno de huesos de osificación endocondral y membranosa, en diferentes circunstancias experimentales. Facultad de Odontología, U. N. Rosario.
    * 1971. Marta C. Romano, Dra. en Medicina. Tesis: Evolución de las metáfisis femorales de la laucha prepúber  tratada con testosterona y Actinomicina D. Facultad de Ciencias Médicas, U. N. Rosario.
    * 1975 Martha B. Locatto, Dra. en Bioquímica. Tesis: Galactosemia experimental. Facultad de Ciencias Bioquímicas, U. N. Rosario.
    * 1982. Digna A. Caferra, Dra. en Bioquímica. Tesis: Metabolismo del citrato en la rata y relación con la biología ósea.  Facultad de Ciencias Bioquímicas, U. N. Rosario
    * 1984 Ana M. Masoni, Dra. en Bioquímica. Tesis: Efecto del 1,25‑dihidroxicole-calciferol-glucósido y el 1,25‑dihidroxicolecalciferol sobre el metabolismo mineral y óseo del pollo raquítico. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, U. N. Rosario
    * 1984. Adriana S. Dusso, Dra. en Bioquímica. Tesis: Efecto del Solanum glaucophyllum y del 1,25‑dihidroxicolecalciferol sobre el metabolismo del hierro en la rata. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, U. N. Rosario.
    * 1990.  Alfredo Rigalli, Dr. en Bioquímica. Tesis: Efecto del fluoruro sobre la formación de  tejido óseo. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, U. N. Rosario
    * 2001. Luis Esteban. Dr. En Ciencias Biomédicas. Tesis: Estudio del metabolismo del complejo a2.macroglobulina y monofluorfosfato de sodio. Relación entre dicho fenómeno y la biodisponibilidad del flúor del MFP respecto del fluoruro. Facultad de Ciencias Médicas  U. N. Rosario
    * 2001. Inés Menoyo. Dra. En Bioquímica. Tesis: Efecto del ión fluoruro sobre la secreción de insulina. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, U. N. Rosario.
    * 2003 Laura Pera. Dra. en Ciencias Biomédicas: Tesis: Identificación de las especies químicas con flúor presentes en hueso de ratas tratadas con monofluorofosfato (MFP). Facultad de Ciencias Médicas  U. N. Rosario.
    * 2003. Verónica Di Loreto. Dra. En Ciencias Biomédicas Tesis: Efectos de la insulina y la glucosa sobre la homeostasis del fosfato en la diabetes experimental. Facultad de Ciencias Médicas  U. N. Rosario.
    * 2006. María F. García,  Dra. En Ciencias Biomédicas. Tesis: Estudio de la dinámica ósea mandibular y de los procesos osteolíticos de la cresta alveolar en ratas diabéticas y controles. Facultad de Ciencias Médicas, U. N. Rosario.

Tesis en ejecución

    * María C. Aguirre. Tesis: Formulación de un modelo matemático para el estudio de la homeostasis de la α-2-macroglobulina.
    * Lucas Brun. Tesis: Investigación de la interacción calcio-fosfatasa alcalina intestinal de rata y su relación con la absorción de calcio.
    * Susana Lioi. Tesis: Estímulo de la síntesis/absorción de triglicéridos por el intestino de la rata hembra causado por elevados niveles de Hormona de Crecimiento.
    * Silvia Purrello Tesis: Elaboración de un método original para el análisis de la postura corporal.
    * María Lorena Brance. Tesis: Estudio del mecanismo de acción del monofluorofosfato de sodio sobre la remodelación ósea en ratas. Evaluación del efecto combinado con drogas anti-resortivas.

Conclusiones

Aprecio las bondades de la investigación científica sobre mi formación así como los frutos del camino recorrido: la adquisición de confianza en la propia capacidad y el aprendizaje de maximizar la utilización de los recursos disponibles. La investigación científica es la gran aventura democrática de nuestro tiempo. Todos los aportes, grandes o modestos, contribuyen a conocer el mundo que nos rodea.

He comprobado en mi camino la vigencia de una expresión de Ramón y Cajal: “Nadie, hasta que lo experimenta, advierte las bondades y los frutos de la atención prolongada en un solo tema”.  Uno debe concentrarse en alcanzar objetivos concretos dentro de un tema hasta que o la propia imaginación o los recursos materiales disponibles, indiquen que es pertinente cambiarlos.

La Naturaleza vende caro sus secretos. He apreciado los beneficios de la interacción multidisciplinaria, no buscada como objetivo, sino surgida por la necesidad espiritual de avanzar en el conocimiento.

La práctica de la investigación científica posibilitó significativas mejoras en las carreras académicas de los docentes de la Cátedra de Química Biológica, la modificación positiva del ambiente del Laboratorio con la consecuente atracción hacia él de jóvenes de estudiantes y el incremento y actualización del equipamiento específico de la Cátedra.

Rosario, Julio 2008
Prof. Dr. Rodolfo C. Puche

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REGLAMENTO

 

 


INFRAESTRUCTURA Y EQUIPAMIENTO

Instalaciones
Se dispone de tres laboratorios y de un bioterio.

Recursos de información
El laboratorio cuenta con una biblioteca actualizada en metabolismo fosfocálcico y en manuales con técnicas de laboratorio. Se cuenta con conexión de internet por ADSL.

Recursos humanos e interrelación del grupo
El grupo de trabajo mantiene semanalmente dos reuniones de discusión de trabajos de investigación y presentación de resultados y proyectos. Estas reuniones son de horarios fijos y poseen control de asistencia. Además semanalmente miembros del grupo participa en el seminario del taller de Tesis del Doctorado en Ciencias Biomédicas de la Facultad de Ciencias Médicas

Equipamiento
Electrodo de ión específico para la determinación de fluoruro (ORION 94-09), adaptado a la determinación en muestras con un límite inferior de volumen de 10 µl. Esta técnica permite la determinación de fluoruro superior a 10-5 M en soluciones acuosas: extractos con EDTA de los huesos, orina, y soluciones acuosas en general. Se cuenta con personal técnico capacitado para el manejo del mismo.
Equipo y técnica de destilación isotérmica de flúor. Este equipo permite el aislamiento del flúor de matrices complejas que impiden la determinación potenciomét¬rica directa utilizando el electrodo ORION 94-09. Esta técnica permite además la concentración de las muestras, cuando los niveles de fluoruro son inferiores al límite de detección del electrodo. Esta metodología permite la determinación de flúor total y ultrafiltrable
Técnica enzimática para la determinación de monofluorofosfato de sodio en fluidos biológicos mediante la hidrólisis de monofluorofosfato de sodio por fosfatasa alcalina y medición de la concentración de fluoruro con la técnica de destilación isotérmica mencionada anteriormente. Estas técnicas están optimizadas de tal manera que hacen posible la determinación de 500 muestras semanales.
Equipo completo de electroforesis, transferencia e isoelectroenfoque de proteínas. compuesto por regulador de temperatura MultiTemp III, fuente: EPS 3500 y MULTIPHOR II Electrophoresis System. Electrodos de grafito Novablot para transferencia. Pharmacia Biotech
Equipamiento para cromatografía de exclusión molecular y de intercambio iónico: Cámara fría para trabajo a 4° C. Equipo Pharmacia Biotech: Gradi Frac System. Bomba Peristáltica P1 y Monitor UV.
Centrifuga refrigerada Hermle Labor Technik Z 323 K
Equipamiento para estudios histológicos: micrótomo Leitz Wetzlab. Microscopios Olympus. Un equipo compuesto por microscopio con cámara y digitalizador de imágenes.
Equipo AMICON para concentración de muestras líquidas por ultrafiltración bajo presión de nitrógeno.
Micromolino Retsch MM200 para pulverizar huesos.
Espectro¬fotómetro Perkin Elmer Lambda 11, equipado con software PECSS. Disponibilidad de cubeta termostatizada, de volúmenes 0,1 - 5 ml.
Espectrofotómetro UV/visible . Ultrospec 1000. Pharmacia Biothech
Para la elaboración estadística, numérica y gráfica se cuenta con hardware adecuado y software de conocida performance.
Quirófano para cirugía en ratas: camilla termostatizada, manómetro de presión, sistema de perfusión. Instrumental de cirugía. Lámpara con aumento y lupa estereoscópica acoplada a digitalizador de imágenes. Horno de esterilización de 140 °C.
3 balanzas de precisión: hasta 0,01 mg.
Espectrofotómetro de absorción atómica Metrolab.
Microscopio con cámara y digitalizador de imágenes.
Contador de centelleo líquido beta Beckman LS 100C

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